外泌体的五大提取方法

外泌体是胞内体逆出芽形成多囊泡胞内体，多囊泡胞内体与细胞膜融合，向细胞外释放形成外泌体。几乎所有的细胞都可以分泌外泌体（直径30~100 nm），其存在于大多数种类的细胞和多种体液当中，同时也存在于大多数种类细胞的培养液中。

外泌体中包含多种成分，如蛋白质、脂质、RNA，其中RNA种类有：mRNA、miRNA及其他非编码RNA。

今天就来给大家普及一下外泌体研究中的第一步：如何高效分离外泌体？

外泌体的提取方法

一、超速离心法

超速离心法是目前最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将大小相同的囊泡从样本中沉淀并纯化出来。外泌体超速离心一般和蔗糖密度梯度离心或蔗糖衬垫组合起来分离低丰度外泌体。需在离心机中以100,000-200,000 x g离心沉淀（含有外泌体）120分钟，使样品中的外泌体在1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范围内进行富集。

该方法的优点在于提取方法简单，提取过程中不会引入其他的标记物，适合大剂量的样品处理。缺点在于操作繁琐，费时费力，操作过程中需要超高速离心，且由于离心力的因素，可能会导致外泌体结构破坏从而对下游实验造成影响，对于一些具有高粘度的生物样品（例如血浆和血清样本），则需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。

二、密度梯度离心法

该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，利用外泌体1.13g/ml-1.21g/ml的密度范围，实现外泌体与非囊泡颗粒（如蛋白质、蛋白质/RNA聚集体等）进行分离，从而能够提取含量低的外泌体。

2018年Li K等人改良了此方案，使用碘克沙醇作为新的一种高效介质，外泌体回收率更高、纯度更高，并且结构和功能保持更好。

三、超滤法

超滤离心法是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。

这种方法比较简单高效，也不影响外泌体的生物活性，但缺点是外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。此外，截留在膜上的外泌体间也会发生粘附，导致产量降低。

Tips：外泌体是直径30~100 nm囊状小体，大于一般蛋白质。采用此方法需要考虑到与外泌体大小相似的其他囊泡的干扰。

四、磁珠免疫法

外泌体表面有其特异性标记物（如CD9，CD81，CD63，CD82，Hsp70，Ras相关蛋白Rab-5b，细胞骨架蛋白肌动蛋白和TSG101等），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。因为外泌体的异质性与它们的起源一致，不同外泌体上的标记物丰度也不同，通过特定的抗体组合可以从样本中捕获不同类型的外泌体，进行选择性分离。

磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

五、尺寸排阻色谱法

这种方法利用多孔的凝胶球，通过分子大小不同将外泌体纯化出来。在分离提取过程中，大分子物质不能进入凝胶孔，很快沿多孔凝胶间的缝隙被流动相洗脱出来，而小分子物质能进入凝胶孔，滞留时间更长，会更慢地被洗脱出来。外泌体的分子粒径大于一般的蛋白分子，所以外泌体会先被洗脱下来，而粒径小的蛋白质会被后洗脱下来，从而分离出高纯度的外泌体。